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來源：環(huán)保工程師

在1986年之前，人們都不相信有可在厭氧環(huán)境下“氧化”氨氮的細菌。一個荷蘭生物工程師和一個微生物教授的偶遇改變了一切。到了1999年7月，這位微生物學(xué)家連同其他幾位學(xué)者，在《Nature》期刊上宣布了一個重大發(fā)現(xiàn)：“厭氧氨氧化”菌屬于浮霉菌門。在日后關(guān)于anammox的文章里，這個人的名字會被反復(fù)引用，他的名字叫Gijs Kuenen。

如果你不知道Gijs Kuenen是誰的話，那說明你對厭氧氨氧化的歷史還知之甚少。如果說誰最有資格為厭氧氨氧化作傳，那可能是非Gijs Kuenen教授莫屬。幸運的是，Kuenen教授最近還真的將過去40年厭氧氨氧化史好好地梳理了一遍，并發(fā)表在2020年第二期的《Environmental Microbiology》上，題為《Anammox and Beyond》。

從硫細菌說起

1940年12月9日，Gijs Kuenen出生于荷蘭阿姆斯特丹西邊的小城Heemstede。1972年，Kuenen教授在格羅寧根大學(xué)獲得微生物學(xué)博士學(xué)位。畢業(yè)后他在美國洛杉磯和荷蘭格羅寧根輾轉(zhuǎn)了幾年，隨后在1980年來到代爾夫特，成為了荷蘭代爾夫特理工大學(xué)TU Delft的第四任微生物教授。前三人都是代爾夫特理工的傳奇人物，包括Martinus Beijerinck、Albert Kluyver和Cornelis van Niel。

Kuenen教授說，每次回想，都讓他愈發(fā)感覺微生物界各種人和事之間奇妙的聯(lián)系。他說關(guān)于anammox的故事可以從他在格羅寧根大學(xué)讀本科的時候說起。當(dāng)時這門課的授課老師是Hans Veldkamp教授(1923-2002)，Veldkamp的導(dǎo)師則是Albert Kluyer (圈子的傳承)。

在為期六周的微生物課里，他學(xué)會了如何對多種微生物和代謝類型進行富集培養(yǎng)，而這種方法正是TU Delft首任微生物教授Martinus Beijerinck發(fā)明的。后來Veldkamp教授則成為了Kuenen教授博士學(xué)位的導(dǎo)師。他的博士論文是關(guān)于兩種硫氧化菌(SOB)的比較。在此后很長的一段時間里，他的研究都是圍繞SOB展開的。

在1980年他回到Delft之后，他開始尋求SOB在工業(yè)上的應(yīng)用。巧合的是，當(dāng)時荷蘭瓦赫寧根大學(xué)的Gatze Lettinga教授正在研究污水的厭氧處理技術(shù)。兩位教授聯(lián)合本地一家叫Paques的小公司，成功地開發(fā)了生物脫硫工藝，去除污水中的硫化氫，并回收單質(zhì)硫。

Paques公司后來也將這項工藝技術(shù)商業(yè)化，取名THIOPAQ。取名者正是Kuenen和Lettinga聯(lián)合培養(yǎng)的博士生Cees Buisman，后來他也成為了瓦大環(huán)境系的教授。

在大學(xué)當(dāng)教授之余，當(dāng)時Kuenen每周會抽幾小時給一家叫Gist-Brocades (GB)的生物公司當(dāng)咨詢顧問。1987年，GB公司請他為公司一套新的污水厭氧處理系統(tǒng)的硫循環(huán)做技術(shù)指導(dǎo)。這套系統(tǒng)本來是要用來解決工廠產(chǎn)生的臭氣問題的。

但在此期間，GB公司的運行人員卻發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)中一個奇怪現(xiàn)象——中試運行數(shù)月后，反硝化反應(yīng)池的氨氮濃度下降了，硝酸鹽也減少了，還有明顯的氮氣產(chǎn)出?！皶锊皇钦f氨氮只能在好氧條件才會轉(zhuǎn)化嗎？反硝化池的氨氮濃度應(yīng)該保持不變才對??？”時任GB公司研究員的Arnold Mulder對此十分不解。他通過領(lǐng)導(dǎo)找到了 Kuenen教授進行咨詢。

圖：1984年的Gist Brocades 青霉素制藥廠 | 圖源: ANP

Mulder先生的發(fā)現(xiàn)喚起了Kuenen教授塵封了10年的記憶，他告訴Mulder：“我10年前就看過一篇paper報道過這個現(xiàn)象。” Kuenen教授指的是1977年67歲的奧地利理論化學(xué)家Engelbert Broda寫的題為《Two kinds of lithotrophs missing in Nature》（德語原題《Zeitschrift für allgemeine Mikrobiologie》）的文章。此文在當(dāng)時學(xué)術(shù)圈可謂一聲驚雷。當(dāng)時37歲的Kuenen也拜讀了這篇文章，并和同事們展開討論，但他們大都認(rèn)為氨是不可能在厭氧條件下被氧化的。

兩人開始了進一步的研究。很有商業(yè)意識的Arnold很快給這個潛在工藝起了一個朗朗上口的名字——ANAMMOX（厭氧氨氧化）。然而，他們初期的嘗試并不算成功：他無法通過傳統(tǒng)的培養(yǎng)富集法提取出這個反應(yīng)發(fā)生的微生物，因此無法確定這是一個自發(fā)的化學(xué)反應(yīng)，還是一個生物反應(yīng)。 

Kuenen此時又想起了奧地利人Broda的文章里列出的兩條熱力學(xué)方程式：

Kuenen教授提議用15-N同位素示蹤技術(shù)來確認(rèn)氮氣是否來自氨氮，并將此重任交給了他的一位女碩士生——Astrid van de Graaf。Astrid在實驗室用流化床反應(yīng)器做實驗，成功發(fā)現(xiàn)了14,15-N2。這個發(fā)現(xiàn)固然讓人激動萬分，但他們還需要更多的證據(jù)來充分印證這個反應(yīng)的生物屬性。

幸運的是，Kuenen教授向荷蘭技術(shù)基金會（STW）申請到資金為Astrid專門開設(shè)一個博士項目，確保后者可以安心將研究進行下去。

在證明生物反應(yīng)的存在后，Astrid接下來要繼續(xù)用15-N示蹤標(biāo)記法識別各種中間物和最終產(chǎn)物，并嘗試富集反應(yīng)的微生物。這項工作的挑戰(zhàn)巨大，別的不說，單考慮到Anammox菌超慢的生長速率(約0.001-0.002/h)，Astrid的工作量就可想而知。她的勇氣也值得欽佩。幸好皇天不負有心人，在一次偶然的嘗試中，他們發(fā)現(xiàn)anammox反應(yīng)的基質(zhì)是亞硝酸鹽，而不是硝酸鹽，而且部分亞硝酸鹽會轉(zhuǎn)化成硝態(tài)氮用于固定二氧化碳。

第一個20年

Kuenen教授在1980年入職TU Delft后的20年可以算是厭氧氨氧化的第一個20年。這個階段以驗證anammox為焦點，在熱力學(xué)方程式為指導(dǎo)，最終通過富集培養(yǎng)、流化床反應(yīng)器、同位素示蹤標(biāo)記等手段證明了anammox的存在，并描繪了基本的代謝路徑。

Astrid在完成她的博士學(xué)位后，并沒有選擇繼續(xù)anammox的研究，1994年，在Delft當(dāng)了6年研究員之后，她選擇到荷蘭科學(xué)中心NEMO做科普內(nèi)容方面的工作。Kuenen教授將下一個挑戰(zhàn)交給了Marc Strous博士，讓他對anammox菌進行富集提純。利用SBR反應(yīng)器，Marc成功地可重復(fù)地培養(yǎng)高產(chǎn)量的anammox菌，純度提高至70％。

有了高純度的微生物，Kuenen教授的團隊可以做更多分析了。他找到澳洲昆士蘭大學(xué)的分子生物學(xué)教授John Fuerst幫忙確認(rèn)目標(biāo)微生物。借助電子顯微鏡的近距離觀察，他們發(fā)現(xiàn)這些細胞有一個奇怪的、靠膜隔開的內(nèi)室。這可是一個大驚喜！要知道，只有更復(fù)雜(真核)細胞才有這種隔室，就像人類細胞擁有的細胞器（organelles）。

他們將這個東西取名厭氧氨氧化體(anammoxosome)。這些細胞器負責(zé)執(zhí)行特定的生物學(xué)功能，對細胞組分、代謝過程和信號傳導(dǎo)途徑起時空控制作用。簡單的原核細胞和細菌都沒有細胞器。目前科學(xué)家只知道浮霉菌（Planctomycetes）具有這種結(jié)構(gòu)，因此研究團隊推斷anammox菌屬于該門。

圖：anammox細胞的透射電子顯微鏡照片和截面手繪圖(比例尺0.2μm)

話說浮霉菌非常奇特，因為它同時含有細菌、真菌和古菌三大菌屬的特性，因此有些人認(rèn)為該菌在早期可能跟三大菌屬是同一個祖先。只是DNA的研究將它們歸在了細菌屬一類?？梢哉f，浮霉菌的出現(xiàn)模糊了細菌的定義。

在此之前，沒有人將浮霉菌門跟厭氧氨氧化拉上關(guān)系，但Kuenen教授的團隊用氨氮和亞硝態(tài)氮培養(yǎng)出了這種細胞，底物也隨反應(yīng)過程消失。這也從側(cè)面說明anammox菌的特別之處。

這個說個題外話：他們將這個第一次測序分析的anammox菌取名Candidatus Brocadia anammoxidans：anammoxidans表示其獨特的生化特性，Brocadia既表示了這些細菌的發(fā)現(xiàn)地(Brocades)，另外也因為這些鮮紅色的細菌讓研究者聯(lián)想到明艷的織錦。

第二個20年

“21世紀(jì)是生物的世紀(jì)?！边@句話雖然更多被拿來揶揄，但在我們看來，到本世紀(jì)再來看，它所表達的可能就變成真知了。就以anammox為例，在2000-2020年之間，關(guān)于它的許多新發(fā)現(xiàn)都有賴于生物技術(shù)的進步。

16S rRNA基因測序的普及幫助科學(xué)家對更多的anammox菌進行命名。例如Mike Jetten和Michael Wagner就說服法國基因測序中心Genoscope幫Kuenen團隊在一個流化床反應(yīng)器的富集物進行DNA，并找出了新的菌種，并以Kuenen的姓命名(Candidatus Kuenenia stuttgartiensis)。測序結(jié)果也顯示基因組相當(dāng)大(4.27 Mb)，還含有大量細胞色素基因，這也解釋了anammox菌呈紅色的原因。

這也開啟了anammox菌的宏基因組分析時代。隨著DNA測序技術(shù)的發(fā)展，Kuenenia菌的基因組通過Mike Jetten教授帶領(lǐng)的團隊得到進一步完善。Jetten團隊開展大量的生物化學(xué)和酶學(xué)研究，在anammox的代謝路徑方面取得了重大突破。例如通過結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)anammoxosome是能量轉(zhuǎn)化的場所，又例如發(fā)現(xiàn)一氧化氮才是許多anammox菌的反應(yīng)中間物(而不是羥胺)。

圖：Jetten團隊總結(jié)的anammoxosome的能量代謝流程圖

可以說，21世紀(jì)以來，厭氧氨氧化研究已經(jīng)遍及各個方面，從基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、環(huán)境和生態(tài)微生物學(xué)。值得一提的是，雖然實驗和分析手段在過去20多年有了很大改進，不過時至今日，科學(xué)家依然無法得到純種的anammox細菌，這也是為什么這些菌目前都以Candidatus命名。Kuenen表示希望他的學(xué)生以及學(xué)生的學(xué)生們可以早日得到單菌株，這樣就可以摘掉Candidatus的前綴。

沒有終點的探索

之前我們提到Mulder先生早在上世紀(jì)80年代末就為Anammox工藝注冊了專利。但因為anammox菌超慢的生長速率，那個年代的人對anammox技術(shù)的前景并不看好，壓根沒有公司感興趣！唯獨Mark van Loosdrecht教授叫他的學(xué)生Udo van Dongen試著去搭一個兩段式的反應(yīng)系統(tǒng)，第一段將部分氨氮氧化成亞硝態(tài)氮，第二段是厭氧氨氧化流化床。實驗結(jié)果成功打動了鹿特丹的Dokhaven污水廠。后者和TU Delft合作進行中試實驗，處理厭氧消化池的高濃度氨氮出水。最后的結(jié)果如今大家都以知道——側(cè)流厭氧氨氧化工藝已經(jīng)成為很成熟的工藝。但可能不為人所知的是，Kuenen教授和Van Loosdrecht教授當(dāng)時可是通過2年多的穩(wěn)定運行才最終打動鹿特丹市所屬的水委會，為這個工藝爭取到了工程驗證的機會。

Kuenen教授在這篇12頁的綜述里，將學(xué)術(shù)界和工程界在1977到2020年里對厭氧氨氧化認(rèn)知的變化都寫了一遍。這是一個關(guān)于時間和耐心的故事。43年，說長不長，說短不短。但對于1972年博士畢業(yè)、2005年退休的Gijs Kuenen教授來說，厭氧氨氧化幾乎貫穿了他的科研生涯。雖然硫氧化菌才是Kuenen教授的摯愛，但最后讓他流芳百世的卻是厭氧氨氧化菌(anammox第二個屬Kuenenia就以他命名)。

Kuenen教授在文章最后說道：“對作者而言，這個故事就到此為止了。但欣慰的是，微生物學(xué)的奇妙旅程仍將繼續(xù)?！边@是一個沒有終點的探索。相信在下一個20年，厭氧氨氧化的研究還有很多驚喜值得期待。（來源：IWA國際水協(xié)會）

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